红曲产品中桔青霉素的测定

　　本方法适用于红曲米、红曲红、红曲发酵液和功能性红曲中桔青霉素的测定。                                              

    试样中的桔青霉素经提取、净化及浓缩后, 根据在高压液相色谱上的出峰面积测定含量。                                                                   

3.1 乙腈：HPLC级；

3.2 磷酸：分析纯或色谱纯；

3.3 甲醇：HPLC级；

3.4 甲苯：分析纯；

3.5乙酸乙酯： 分析纯；

3.6甲酸：分析纯；

3.7水：去离子水

3.8乙醇：色谱纯

3.9桔青霉素标准溶液:：准确称取桔青霉素标准品（美国Sigma公司），用甲醇溶解，制成500 mg/L的储藏液， 工作液稀释到100mg/L，置4°C冰箱中备用。

3.10高压液相色谱洗脱剂：乙腈-去离子水（用色谱纯磷酸调pH至2.5）[35+65，v/v]                                           

4.1 高效液相色谱仪；

4.2色谱柱：Eclipse XDB C₁₈反相色谱柱，250 × 4.6mm, 粒度直径为5μm；

4.3试样环：20μL；

4.4检测器：荧光检测器，λ_ex=331，λ_em=500；

4.5 VCX 400超声波细胞破碎仪；

4.6电子天平：千分之一或万分之一；

4.7 pH计：精度为0.01；

4.8匀浆器；

4.9离心机；

4.10旋转蒸发器；

4.11 分光光度计

4.12 0.45μm的微孔偏氟滤膜；

4.13具塞试管；

4.14烧杯；

4.15比色管。

5.1.1红曲米样品的预处理                                                    

    准确称取粉碎的红曲米粉（细度达到测定色价时的要求）0.5—3.0g(根据红曲样品中的桔青霉素含量高低而定) 于50mL烧杯中，加入20mL复合萃取剂甲苯：乙酸乙酯：甲酸（7：3：1，v/v），称重，记录下连烧杯在内的重量，超声波处理10min（强度40%，5s，5s），自然澄清后称重，如果重量低于原重量，需用复合萃取剂补足。将上清液移入50mL具塞试管中，残渣中另加入15mL复合萃取剂，第二次称重并超声波处理（10min），自然澄清后称重，用复合萃取剂补足至超声处理前的重量，上清液移入50mL具塞试管，残渣用15ml复合萃取剂再重复提取一次。合并三次提取液，充分混匀后取30ml离心（3000rpm，20 min），上清液真空浓缩至干后溶于30ml甲醇中，微滤后取20μl 进行HPLC分析。

5.1.2液态发酵液的预处理

用均质器将发酵液中的菌丝打碎，取10mL均匀打碎的发酵液于比色管中，用乙醇定容至25mL，60℃加热1h（期间不断振摇），3000rpm离心15min，上清液微滤后取20μl进行HPLC分析。